Die Wirksamkeit von aus Hühnerdärmen und Rinderstämmen isolierten Bakteriophagen zur Kontrolle von Biofilmen

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 8222 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Biofilm wird zu einem der größten Probleme der Lebensmittelsicherheit in der Lebensmittelindustrie, da die Bildung von Biofilm eine Kontaminationsquelle sein kann. Um das Problem zu lösen, setzt eine Industrie im Allgemeinen physikalische und chemische Methoden ein, darunter Desinfektionsmittel, Desinfektionsmittel und antimikrobielle Mittel, um Biofilm zu entfernen. Der Einsatz dieser Methoden kann jedoch neue Probleme mit sich bringen, nämlich die Bakterienresistenz im Biofilm und das Risiko einer Produktkontamination. Es sind neue Strategien zum Umgang mit bakteriellen Biofilmen erforderlich. Bakteriophagen (Phagen) haben sich als umweltfreundliche Alternative zu Chemikalien wieder als vielversprechender Ansatz zur Behandlung von bakteriellem Biofilm erwiesen. In der vorliegenden Studie wurde das Potenzial lytischer Phagen untersucht, die eine Antibiofilm-Aktivität gegen biofilmbildende Bakterien (Bacillus subtilis) haben. Sie wurden aus Hühnerdärmen und Rinderpansen isoliert, die auf traditionellen indonesischen Märkten bezogen wurden, und zwar unter Verwendung von aus diesen Proben isolierten Wirtszellen. Die Phagenisolierung wurde mithilfe der Doppelschicht-Agar-Technik durchgeführt. An biofilmbildenden Bakterien wurde ein lytischer Phagentest durchgeführt. Der Unterschied im Trübungsgrad zwischen der Kontrolle (die nicht mit Phagen infiziert war) und den Reagenzgläsern, die mit Phagen infizierte Wirtsbakterien enthielten, wurde untersucht. Die Infektionszeit für die Produktion von Phagen wurde basierend auf dem Grad der Klarheit der Medien im Reagenzglas bei einer längeren Lysatzugabezeit bestimmt. Drei Phagen wurden isoliert, nämlich: ϕBS6, ϕBS8 und ϕUA7. Es zeigte die Fähigkeit, B. subtilis als biofilmbildende Verderbnisbakterien zu hemmen. Die besten Hemmergebnisse wurden mit ϕBS6 erzielt. Eine Infektion mit ϕBS6 in B. subtilis führte zu einer Verringerung des 0,5-Log-Zyklus in Bakterienzellen. Diese Studie zeigte, dass isolierte Phagen als potenzieller Ansatz zur Bewältigung des Problems der Biofilmbildung durch B. subtilis eingesetzt werden könnten.

Die jüngsten Ausbrüche lebensmittelbedingter Erkrankungen können auf Biofilme zurückgeführt werden. Die Bildung von Biofilmen ist ein integraler Bestandteil des mikrobiellen Lebenszyklus in der Natur. Lebensmittelbedingte Krankheitserreger bilden als Überlebensstrategie in verschiedenen ungünstigen Umgebungen Biofilme, die auch zu einer häufigen Quelle wiederkehrender Kontaminationen und Ausbrüche lebensmittelbedingter Krankheiten werden1. Ungefähr 60 Prozent der Ausbrüche von lebensmittelbedingten Krankheiten werden laut Untersuchungen zur Lebensmittelsicherheit2 durch Biofilme verursacht. Biofilm ist eine Form der bakteriellen Anpassung, die sich an der Oberfläche ansiedelt und festsetzt, die von extrazellulärem Polymermaterial bedeckt ist3. Es wird zu einem großen Problem in der Lebensmittel-, Gesundheits- und Meeresindustrie4. 80 Prozent der durch pathogene Bakterien verursachten Ausbrüche werden durch biofilmbildende Bakterien verursacht5. Die Bildung von Biofilmen durch pathogene Bakterien, insbesondere in den Verarbeitungsanlagen, ist eine große Herausforderung in der Lebensmittelindustrie. In der Lebensmittelindustrie – wie der Brauindustrie, der Verarbeitung von Milchprodukten, Frischprodukten und Fleisch – stellt das Vorhandensein von Biofilm in der Produktionslinie eine Kontaminationsquelle für Lebensmittel dar, die die Produktionslinie durchlaufen6,7,8. Die Bildung von Biofilmen hat auch negative Auswirkungen auf die Non-Food-Industrie wie die Ölbohrindustrie, die Papierproduktion und Gesundheitsprodukte/Medikamente9,10. Biofilme führen zu Schwierigkeiten im Produktionsprozess, da sie die Wärmeübertragung verringern, Rohre und Filter verstopfen und Oberflächenschäden an Geräten verursachen können11,12.

Die bisher von der Industrie angewandte Strategie zur Kontrolle der Bildung von Biofilmen besteht in der Verwendung von Chemikalien wie Säuren, oxidierenden Verbindungen (Chlor, H2O2) und Tensiden13,14,15. Der Einsatz dieser Chemikalien bringt jedoch Einschränkungen mit sich. Es kann zu Kreuzkontaminationen und Vergiftungen kommen. Die größte Herausforderung bei der Verhinderung der Bildung von Biofilmen besteht darin, dass sie bekanntermaßen eine hohe Resistenz gegen antimikrobielle Mittel, Antibiotika, Desinfektionsmittel und Desinfektionsmittel aufweisen, was ihre Entfernung erschwert16,17,18,19. Darüber hinaus führen Biofilme dazu, dass Bakterien eine höhere Widerstandsfähigkeit gegenüber hohen Temperaturen, UV-Strahlen, Röntgenstrahlen, Trockenheit usw. aufweisen20,21,22. Zur Bekämpfung von Biofilmen ist ein neuer Ansatz erforderlich. Eine der potenziellen alternativen Lösungen, die untersucht werden können, ist der Einsatz von Bakteriophagen (Bakterienviren), die in der Lage sind, biofilmbildende Bakterien zu lysieren23,24. Bacillus spp. ist eines der Bakterien, die in der Lebensmittelindustrie häufig Probleme im Zusammenhang mit der Bildung von Biofilmen verursachen25,26. Die Biokontrollstrategie durch Bakteriophagen zur Reduzierung von Biofilmen ist heute eine akzeptable Strategie, da sie natürlicher ist als die herkömmlichen Methoden mit Chemikalien zur Verbesserung der Lebensmittelsicherheit. Der Trendwechsel der Verbraucher hin zu natürlichen statt chemischen Produkten sowie zunehmende Gesundheits- und Umweltbedenken führen zu einer Nachfrage nach neuen „grünen“ Technologien in der Lebensmittelverarbeitung. Bisher wurden mehrere Phagen und Endolysine verwendet, um die Bildung von Biofilmen mehrerer Bakterien zu hemmen, darunter E. coli O157:H7, Bacillus spp., Salmonella spp., Campylobacter spp., Listeria spp., Staphylococcus spp., Cronobacter spp., Vibrio spp., Clostridium spp., Campylobacter jejuni und Pseudomonas spp.27,28,29.

Ziel der aktuellen Studie war es, Bakteriophagen aus Hühnerdarm und Rinderpansen zu isolieren, die die Fähigkeit besitzen, das biofilmbildende Bakterium Bacillus subtilis zu hemmen. Es wurde die Lysefähigkeit von Bakteriophagen untersucht, die gegen mehrere Zielbakterien isoliert wurden. Aus dieser Studie gingen wir davon aus, dass isolierte Phagen als Strategie zur Bekämpfung der Biofilmbildung und als Alternative zu herkömmlichen Methoden in Frage kommen könnten.

Bei den verwendeten Proben handelte es sich um Hühnerdarm und Rinderpansen, die von traditionellen indonesischen Märkten bezogen wurden. Es handelte sich um etwa 5 g Hühnerdarm und Rinderpansen, die jeweils in zwei separate Plastikbehälter mit 45 ml destilliertem Wasser gegeben wurden (Verdünnungsbehandlung 10–1). Anschließend wurden die Hühnerdarm- und Rinderpansenproben 60 s lang bei hoher Geschwindigkeit homogenisiert. Die Aliquots der Hühnerdärme und Rinderpansen waren für die Isolierung von Wirtsbakterien und Bakteriophagen bereit.

Die Phagenisolierung erfolgte basierend auf der von30 vorgeschlagenen Methode. Insgesamt 15 ml Aliquotprobe wurden bei 6500 U/min und einer Temperatur von 27 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Spritze entnommen und mit einem 0,22-µm-Sterilfilter filtriert. Das erhaltene Filtrat war frei von Bakterien und enthielt vermutlich den gewünschten Bakteriophagen. Insgesamt 100 µL Phagenfiltrat und 100 µL 0,3 M CaCl2 wurden zu 3 ml weichem NA hinzugefügt, das 100 µL 20 Stunden gealterte Wirtsbakterien enthielt. Die Mischung in der weichen NA wurde verwirbelt, um sie gut zu vermischen. Dann wurde das weiche NA auf das harte NA in der Petrischale gegossen und man ließ es erstarren, um eine Doppelschicht zu bilden. Doppelschichtagar wurde 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Phagen werden gefunden, wenn das Doppelschichtagar Plaque enthält. Die in dieser Studie getesteten isolierten Phagen wurden bei –4 °C gelagert und sind im Biotechnologielabor der Universitas Brawijaya, Malang, erhältlich.

Jede Probe wurde nach Bedarf verdünnt, dann wurden die letzten drei Verdünnungen mithilfe der Streuplattenmethode in drei Petrischalen mit NA gegossen. Die Schalen mit der Probenkultur wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die einzelne Kolonie wurde entnommen und als Wirtsbakterienkulturstamm in schräge NA überführt31.

In mehrere Reagenzgläser mit 7 ml NB wurden 100 µL 20 Stunden alte Wirtsbakterien gegeben. Insgesamt 100 µL 0,3 M CaCl2 und 100 µL Phagen wurden in das Reagenzglas mit der Wirtsbakterienkultur gegeben. Die Reagenzgläser wurden bei 37 °C inkubiert und alle 30 Minuten beobachtet, bis ein signifikanter Unterschied im Grad der Trübung zwischen den Kontrollen (die nicht mit Bakteriophagen infiziert waren) und den Reagenzgläsern, die mit Bakteriophagen infizierte Wirtsbakterien enthielten, festgestellt wurde. Der Infektionszeitpunkt wurde definiert, als der Phagen die Wirtsbakterienkulturen infizierte, nachdem er zu einem bestimmten Zeitpunkt kultiviert worden war. Die Infektionszeit wurde bestimmt, indem der Phagen die Wirtsbakterienkulturen (B. subtilis) infizierte, die 0, 30, 60, 90 und 120 Minuten lang bei 37 °C und 75 U/min inkubiert wurden. Positive Testmedien (die Medien wurden klar) wurden mithilfe eines Sterilfilters filtriert, um Phagenlysate (Filtrate mit Bakteriophagen) zu erhalten, die dann zur Produktion von Phagen verwendet wurden32,33.

2,5 % der 20 Stunden alten Wirtsbakterienkultur wurden zu den 10 ml TSB-Medium gegeben. 2,5 % Phagenlysat und 0,3 M CaCl2, bis zu 2,5 %, wurden hinzugefügt, um die Phagenadsorption an die Wirtsbakterien zu erhöhen. Das Phagenlysat und die Wirtsbakterienkulturmischung wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde 20 Minuten lang bei 8000 U/min zentrifugiert und der Phagenüberstand mit einer 0,22-mm-Membranfiltration filtriert, um ein bakterienzellfreies Phagenlysat zu erhalten30.

Biofilme wurden gemäß dem für die Biofilmbestätigung aufgeführten Verfahren formuliert. Sobald der Biofilm formuliert war, wurde der SS-Objektträger zusammen mit dem Biofilm auf ein neues Medium übertragen. Dem Medium wurde Phagenlysat mit einem Biofilm von 107PFU/ml zugesetzt. Die Konzentration der biofilmbildenden Bakterien und der endgültigen Bakteriophagen wurde unter Verwendung von Standard Plate Count (SPC) und Doppelschichtagar34 berechnet.

Biofilm wurde mit der folgenden Methode erzeugt35: Edelstahlobjektträger (SS-Objektträger) wurden über Nacht in eine 0,2 %ige handelsübliche Reinigungslösung getaucht. Anschließend wurden die SS-Objektträger erneut in eine neue handelsübliche Reinigungslösung mit warmem Wasser getaucht und 5 Minuten lang gerührt. Mit Reinigungsmittel behandelte SS-Objektträger wurden dann mit destilliertem Wasser gewaschen und in neues destilliertes Wasser getaucht. Anschließend wurden die SS-Objektträger 15 Minuten lang bei 121 °C sterilisiert. Der sterile SS-Objektträger wurde in eine Petrischale mit 6 cm Durchmesser gelegt, die 15 ml steriles TSB, ergänzt durch 0,25 % Glucose, enthielt. B. subtilis wurde in TSB-Medium bei 37 °C unter Rühren mit 75 U/min gezüchtet. 50 µL B. subtilis mit OD > 0,24 wurden in das TSB-Medium gegeben und mit 20 µL 0,9 % NaCl-Lösung versetzt. Anschließend wurden sie 72 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, wobei alle 12 Stunden das Medium gewechselt wurde.

Die Verwendung von Proben von Rinderpansen und Hühnerdärmen zur Phagenisolierung in dieser Arbeit ist darauf zurückzuführen, dass diese Proben ein Lebensraum für Bacillus subtilis sein können. Von jeder Probe wurden zehn Isolate von Wirtsbakterien beobachtet und als Stammkultur für die weitere Phagenisolierung verwendet. Aus 10 Isolaten von Hühnerdärmen und 10 Isolaten von Rinderpansen wurden drei Isolate mit Plaquebildung – nämlich BS6 und BS8 aus Rinderpansen; UA7 aus Hühnerdärmen – wurden beobachtet. Die Identifizierung durch Gram-Färbung bestätigte, dass BS6 Gram-positiv ist, während BS8 und UA7 Gram-negativ sind. Der Isolierungsprozess von Phagen unter Verwendung von BS6, BS8 und UA7 als Wirtsstämmen führte zur Bildung von Plaque auf dem Agar (Abb. 1a). Die Plaquebildung weist darauf hin, dass in den Proben Bakteriophagen vorhanden sind. Allerdings sind Phagen für einige Bakterien spezifisch, sodass nur mehrere aus den Proben isolierte Wirtsbakterien infiziert werden können und die Plaquebildung gezeigt wird. Die aus dieser Isolierung erhaltenen Plaques zeigen klare Plaques, was darauf hindeutet, dass es sich bei den isolierten Phagen um lytische und nicht um temperierte Phagen handeln sollte. Um die lytische Aktivität und die Virulenz des Bakteriophagen nachzuweisen, wurde ein Test auf lytische Aktivität (Trübungstest) durchgeführt. Durch den Vergleich der Trübung infizierter und nicht infizierter Wirtsbakterien konnte die lytische Aktivität des Phagen beobachtet werden (Abb. 1b).

Plaque der Phagen ϕBS6, ϕBS8 und ϕUA7 auf dem Rasen des BS6-Isolats, BS8-Isolats bzw. UA7-Isolats (a). Trübungsvergleich von infiziertem (I) und nicht infiziertem (U) auf BS6-Isolat, BS8-Isolat bzw. UA7-Isolat (b). Im infizierten Röhrchen werden die Wirtsbakterien von den Bakteriophagen lysiert, wodurch die Trübung abnimmt. Im nicht infizierten Röhrchen wachsen nur die Wirtsbakterien, wodurch die Trübung zunimmt.

Der Trübungstest zeigte, dass die Trübung der infizierten Wirtsbakterien deutlich abnahm und sich deutlich von den nicht infizierten Wirtsbakterien unterschied. Es deutete darauf hin, dass der isolierte Phagen eine hohe lytische Aktivität und ein Potenzial für die Anwendung zur Kontrolle des Wachstums von Wirtsbakterien aufwies. Der Trübungsgrad der Bakterienzellen nahm mit der Zunahme der Anzahl der infizierten Bakterienzellen ab32. Dies geschah, weil die vom Virus produzierten Lyse verursachenden Enzyme mit Bakterienzellen vermischt und auf der Zelloberfläche absorbiert wurden, wodurch die Bindungen zwischen den Bakterienzellwänden aufgebrochen wurden. Durch die Isolierung wurden erfolgreich drei Phagen erhalten, die eine hohe lytische Aktivität gegen Wirtsbakterien aufwiesen, nämlich ϕBS6, ϕBS8 und ϕUA7. Aus den Ergebnissen der Lyse der infizierten Wirtsbakterien wurde eine Filtration (0,22 μm) und Reinigung durchgeführt, um eine hohe Konzentration an Phagen zu erhalten.

Die Phagenproduktion wurde durchgeführt, um eine hohe Phagenkonzentration zu erreichen. Die Anzahl der gesammelten Phagen wurde durch den Zeitpunkt der Phageninfektion der Wirtszellen beeinflusst. Abbildung 2 zeigt die Auswirkung unterschiedlicher Phageninfektionszeiten auf das Wachstum der Wirtszelle (BS6, BS8 und UA7).

Die Auswirkung einer zeitlichen Infektion auf die Lysezeit von Bakteriophagen in Wirtsbakterien (a) BS6, (b) BS8 und (c) UA7.

Der genaue Infektionszeitpunkt für jeden Bakteriophagen wurde auf der Grundlage des Wachstumsprofils der Wirtsbakterien festgelegt. Der Inokulationszeitraum der Wirtsbakterien, der einen Anstieg der OD und dann einen signifikanten Rückgang verzeichnete, wurde als der richtige Zeitpunkt für den Infektionsprozess der Wirtsbakterien genutzt, um die Konzentration der Bakteriophagen zu erhöhen. Es wurde festgestellt, dass es nach dem Lysezyklus einen Zeitraum gibt, in dem die Wirtszelle nach der Adsorption durch den Bakteriophagen noch in der Lage ist, den Bakteriophagen zu replizieren (der Zeitraum kann durch die Vermehrung der Wirtszelle dargestellt werden)36. Darüber hinaus folgt auf diesen Zeitraum ein Zeitraum, in dem der zur Freisetzung bereite Bakteriophage die Lyse des Wirtsbakteriums verursacht und der neue Bakteriophage bereit ist, andere Wirtszellen in der Umgebung zu infizieren (der Zeitraum wird durch die Abnahme angezeigt). beim Wachstum von Wirtszellen). Abbildung 2 zeigt, dass die geeignete Infektionszeit für jede Wirtszelle 90 Minuten für BS6 und UA7 und 30 Minuten für BS8 betrug. Der Zeitpunkt der Phageninfektion der Wirtsbakterien basiert auf der hohen Lysefähigkeit der Phagen, hohe Konzentrationen an Phagentitern zu produzieren. Die verfügbare Bakterienkonzentration des Wirts beeinflusst die hohe Titerkonzentration. Je mehr Wirtszellen für eine Phageninfektion zur Verfügung stehen, desto höher ist die Konzentration der während des Lysevorgangs freigesetzten Phagen, was zu einem hohen Phagentiter führt. Im Fall von BS6 und UA7 wurde die Infektionszeit auf 90 Minuten gewählt, da dadurch eine große Anzahl von Wirtszellen bereitgestellt werden kann, den Phagen aber dennoch ermöglicht wird, Wirtszellen effektiv zu lysieren, sodass die während des Lysevorgangs freigesetzten Phagen eine relativ hohe Konzentration aufweisen . Das Gleiche geschah in BS8, jedoch nach einer Infektionszeit von 30 Minuten. Nach dem Infektionsstadium wurde die Anzahl der Bakteriophagen berechnet. Der Phagenvermehrungsprozess, der mit der verfügbaren Infektionszeit durchgeführt wurde, erzeugte die in Tabelle 1 gezeigte Anzahl an Phagen.

Mehrere biofilmbildende Zielbakterien wurden verwendet, um das Hemmspektrum der isolierten Phagen (ϕBS6, ϕBS8 und ϕUA7) zu bestimmen. Die Zielbakterien waren Pseudomonas fluoreszenz, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus und Salmonella typhi. Die Phagenhemmung gegen Zielbakterien ist in Tabelle 2 dargestellt.

Die Ergebnisse zeigten, dass nur B. subtilis durch Phagen gehemmt werden konnte, weshalb B. subtilis als Zielbakterium für die Biofilmbildung im nächsten Schritt ausgewählt wurde. B. subtilis gilt aufgrund seiner einfachen morphologischen und genetischen Diversifizierung als eines der im Labor am häufigsten untersuchten grampositiven, nicht pathogenen Biofilm-produzierenden Bakterien37. Es wurde angenommen, dass die Infektion von B. subtilis durch Phagen auf die Eignung des Phagenrezeptors für B. subtilis zurückzuführen ist. Bakteriophagen verfügen über mehrere Rezeptoren für ihre Bindung und hängen auch von der Wandkomponente der Wirtszelle ab38. Es ist bekannt, dass der Hemmbereich von Phagen mit den Rezeptoren zusammenhängt, die sie besitzen. Wenn ein Phagen über einen Rezeptortyp für die Wirtszelle verfügt, verfügt er über eine begrenzte Hemmfähigkeit. Wenn der Phagen jedoch über mehr als einen Rezeptor verfügt, ist der Wirkungsbereich der Hemmung gegen die Wirtszelle größer. Dieser isolierte Phagen kann über mehr als einen Rezeptortyp verfügen, sodass er sowohl Gram-positive als auch Gram-negative hemmen kann. Phagen sind typischerweise hochspezifisch und oft auf bestimmte Stämme innerhalb einer einzelnen Bakterienart beschränkt. Einige Bakteriophagen haben jedoch ein relativ breites Wirtsspektrum und infizieren mehrere Arten innerhalb einer Gattung und können sogar Mitglieder anderer Gattungen infizieren, die eng mit ihrem üblichen Wirt verwandt sind. Es gibt große Unterschiede zwischen grampositiven und gramnegativen Wirtsrezeptoren, wodurch das Spektrum der Bakteriophagen eingeschränkt wird. Von den drei Wirtsbakterien war BS6 das einzige grampositive Bakterium, während die anderen beiden (BS8 und UA7) gramnegative Bakterien waren. Es konnte verstanden werden, dass ϕBS6 B. subtilis am besten hemmte, da sowohl B. subtilis als auch BS6 grampositive Bakterien waren, ϕBS6 jedoch keine anderen grampositiven Bakterien wie Listeria und S. aureus infizieren konnte. Darüber hinaus konnten ϕBS8 und ϕUA7 P. fluorescens, E. coli und Salmonellen nicht infizieren, obwohl es sich bei ihnen allesamt um gramnegative Bakterien handelte. Aufgrund dieser Tatsache kann davon ausgegangen werden, dass die Nichtinfektion der Wirtszelle durch Phagen eher auf den Einfluss der Infektionszeit und der Dauer der Phageninfektion als auf die Rezeptorkompatibilität zurückzuführen ist. Eine andere Annahme ist, dass die Unfähigkeit von ϕBS8 und ϕUA7, gramnegative Bakterien zu infizieren, vom Bindungstyp ist. Es gibt zwei Arten der Phagenbindung an der Bakterienoberfläche: die reversible und die irreversible Bindung. Bei der reversiblen Bindung besteht die Möglichkeit, dass der Phagen von den Bakterien abgespalten wird, während bei der irreversiblen Bindung das Gegenteil geschieht39. Es wird erwartet, dass die beiden Phagen (ϕBS8 und ϕUA7) reversibel an die gramnegativen Bakterien (P. fluorescens und E. coli und Salmonella) binden, was zu einer falschen Bakterienhemmung führt. Diese Annahme könnte als grundlegender Hintergrund für weitere Untersuchungen des Infektionsverhaltens von ϕBS8 und ϕUA7 dienen. Als neues Wirtsbakterium wurde die Fähigkeit von B. subtilis zur Bildung von Biofilmen erneut bestätigt (Abb. 3).

Der Biofilm aus Bacillus subtilis bildete sich unter statischen Bedingungen mit Medienerneuerung alle 12 Stunden. \(\to\) Pfeil zeigt Biofilmbildung an.

Um das Ausmaß der Hemmung pro Phagen gegen B. subtilis herauszufinden, wurde ein lytischer Aktivitätstest gegen B. subtilis durchgeführt, wie in Abb. 4 dargestellt.

Phagenhemmung gegen Bacillus subtilis.

Die Daten zeigten, dass ϕBS6 und ϕBS8 das Wachstum von B. subtilis verringern könnten, wobei ϕBS6 eine stärkere Hemmung bewirken könnte als ϕBS8. Anschließend wurde der Bakteriophage durch Infektion von B. subtilis mit ϕBS6 mit zwei unterschiedlichen Infektionszeiten (4 und 6 Stunden) appliziert. Der Infektionsprozess zeigte, dass die Gesamtzahl der B. subtilis-Bakterien im Biofilm nach der Infektion mit ϕBS6 abnahm (Abb. 5).

Bacillus subtilis-Biofilminfektion mittels ϕBS6 – Bakterienzahl (a), Phagenzahl (b). Es wurde beobachtet, dass die Bakterienzahl abnahm, während die Phagenzahl zunahm, was darauf hindeutet, dass ϕBS6 den B. subtilis-Biofilm hemmen kann.

Eine Phageninfektion bei B. subtilis zeigte, dass die Gesamtzahl der B. subtilis-Bakterien nach einer Infektion mit ϕBS6 abnahm. Der Kontrollbiofilm enthielt insgesamt 1,50 × 106 KBE ml–1 Bakterien, während die mit ϕBS6 für 4 und 6 Stunden infizierten Biofilme insgesamt 9,50 × 105 KBE ml–1 bzw. 4,90 × 105 KBE ml–1 Bakterien aufwiesen . Die Gesamtabnahme der erhaltenen B. subtilis-Bakterien betrug 0,5 log-Zyklus. Es steht im Einklang mit der Studie von40, dass der Phagen ϕ29 nach 48 Minuten Infektion einen signifikanten Einfluss auf die Gesamtzahl von B. subtilis zu haben beginnt. Das Gesamt-ϕBS6 zeigte, dass es während der Infektion zu einem Rückgang der ϕBS6-Anzahl kam, gefolgt von einem Anstieg um 1 log-Zyklus. Die anfängliche Menge an hinzugefügtem ϕBS6 betrug 1,12 × 107 PFU ml–1, während nach 4-stündiger und 6-stündiger Biofilminfektion die Gesamtmenge der erhaltenen Bakteriophagen 9,70 × 105 PFU ml–1 bzw. 1,73 × 107 PFU ml–1 betrug (Abb. 5). Der Rückgang deutete darauf hin, dass ϕBS6 in die Latenzphase überging, in der der Bakteriophage den Adsorptionsprozess durchführte und sein genetisches Material in die Bakterien einfügte. Es wurde angegeben, dass sich die latente Phase auf die Phase bezieht, in der einzelne Zellen infiziert werden, andere Zellen jedoch nicht infizieren. Dies bedeutet, dass während der Latenzphase die Bakteriophagen-DNA in die Bakterienzelle gelangt ist und keine Lyse stattgefunden hat36. Nach der Latenzphase tritt der Bakteriophage in die lytische Phase ein, in der der Bakteriophage zusammengesetzt wird und bereit ist, aus der Bakterienzelle entfernt zu werden. In dieser Phase nimmt die Anzahl der Bakteriophagen zu, wie in Abb. 5 dargestellt. Diese Daten bestätigen, dass ϕBS6 ein vielversprechender Kandidat für die Hemmung der Biofilmbildung von B. subtilis sein könnte. Es muss jedoch noch eine weitere Studie durchgeführt werden, um Bakterienisolate zu identifizieren, die für die getesteten Phagen anfällig sind, und um die Anti-Biofilm-Aktivität der Bakteriophagenmischung gegen B. subtilis und andere Zielpathogene zu testen. Darüber hinaus muss eine Untersuchung des Potenzials dieser Phagen bei der Lyse anderer potenzieller Krankheitserreger als B. subtilis durchgeführt werden, damit diese Ergebnisse einen erheblichen Einfluss auf die Phagenbehandlung zur Reduzierung von Fällen lebensmittelbedingter Krankheiten zusammen mit Antibiotika haben werden.

Der Isolierungsprozess eines Bakteriophagen unter Verwendung von Proben von Rinderpansen und Hühnerdarm ergab drei Bakteriophagen-Isolate mit lytischen Eigenschaften, die aus zwei Isolaten von Rinderpansen (ϕBS6 und ϕBS8) und einem Isolat des Hühnerdarms (ϕUA7) stammten. ϕBS6 zeigte die beste Infektion mit der höchsten Abnahme des Wachstums von Bacillus subtilis, die 0,5 log-Zyklus betrug. Diese Studie bestätigt, dass isolierte Phagen ein vielversprechendes Potenzial als Biokontrollmittel für biofilmbildende Bakterien haben.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

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Wir danken der Generaldirektion für Hochschulbildung, dem indonesischen Bildungsministerium und der Universitas Brawijaya, Malang, für ihre finanzielle Unterstützung bei der Durchführung dieser Arbeit.

Abteilung für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie, Brawijaya-Universität, Malang, 65145, Indonesien

Agustin Krisna Wardani, Efendi Oulan Gustav Hakim Nata Buana und Aji Sutrisno

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AKW konzipierte die Idee, plante das Projekt, überwachte die gesamte Forschung, interpretierte die Daten, überprüfte und redigierte das Manuskript. EOGHNB führte die Experimente und Datenanalysen durch und war maßgeblich an der Erstellung des Originalmanuskripts beteiligt. AS hat das Manuskript überprüft und bearbeitet.

Korrespondenz mit Agustin Krisna Wardani.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wardani, AK, Buana, EOGHN & Sutrisno, A. Die Wirksamkeit von aus Hühnerdarm und Rinderstämmen isolierten Bakteriophagen zur Bekämpfung biofilmbildender Bakterien, Bacillus subtilis. Sci Rep 13, 8222 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35474-0

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Eingegangen: 07. Mai 2022

Angenommen: 18. Mai 2023

Veröffentlicht: 22. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35474-0

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